ACS central science：具有生物膜局部放大杀菌效应的银纳米团簇反应组装增强对多药耐药细菌感染的治疗

细菌生物膜对公众健康构成重大威胁，因为它们对大多数当前的治疗方法具有抵抗力。常规抗生素在生物膜的酸性微环境中表现出有限的渗透性和减弱的活性。在此，本文报道了由自组装的银纳米簇和pH敏感的电荷反转配体组成的生物膜响应性纳米抗生素（rAgNAs），其在生物膜微环境中可以选择性地增强其杀菌活性。在中性生理条件下，rAgNAs的杀菌活性是自抑制的，因为有毒的银离子的释放被大大抑制了。然而，进入酸性生物膜微环境后，rAgNAs不仅显示出电荷逆转以促进局部积累和保留，而且还分解成小的银纳米簇，从而实现了深度渗透和加速的银离子释放，大大增强了杀菌活性(图1)。

图1 pH控制的组装/拆卸策略，用于制造生物膜反应的纳米抗生素(RAgNAs)，以加强生物膜相关感染的治疗

首先，通过银纳米团簇和pH敏感的电荷逆转配体（PEG-PSB-PALA）的自组装构建rAgNA，PEG-PSB-PALA是通过开环聚合和1-（3-氨基丙基）咪唑（API）的氨解反应合成的。随着pH值的降低，PEG-PSB-PALA的咪唑基团被离子化，从而能够在酸性微环境中分解rAgNA（图2a）。当pH从7.4降低到5.5时，透射电子显微镜（TEM）图像显示rAgNAs很好地分散在中性溶液中，而在酸性溶液中被分解成孤立的AgNCs（图2c），同时流体动力学尺寸观察到水动力尺寸从∼150急剧减小到∼8 nm，溶液变得透明（图2d-e）。此外，随着pH的降低，电荷开关也从−3.85±0.52升至28.77±1.00 mV（图2f）。通过从系统中除去咪唑基团，由AgNC和聚（乙二醇）-聚（β-苯甲酰胺-天冬氨酸）-聚丙氨酸（PEG-PIB-PALA）组成的银纳米组件（uAgNA） pH依赖的性能，既没有尺寸转换，也没有UV-vis吸收光谱的峰位移证明。有趣的是，归因于pH响应的分解作用，在酸性环境中，rAgNAs的银离子浸出得以极大地加速（图2g），这表明生物膜中的全身性副作用减少和局部活化。

图2 pH响应型纳米抗生素(RAgNAs)的制备与表征

其次，在浮游细菌和细菌生物膜上都探索了rAgNA的pH响应杀菌作用。对于浮游细菌，rAgNAs的最小抑制浓度（MIC）~50 μg/mL，最小杀菌浓度（MBC）为~50 μg/mL。（图3a，b）。如图3c所示，与uAgNAs相比，在保持pH 7.4的培养基中rAgNAs的活性可以显着降低，这证明了rAgNAs在酸性微环境中的选择性活性增强。通过扫描电子显微镜（SEM）（图3d）和TEM图像（图3e）观察到膜起泡和细菌结构的破坏，这表明rAgNAs对浮游细菌的作用是银离子浸出破坏了膜的完整性，rAgNAs对浮游细菌的体外杀菌作用与万古霉素相当（图3f）。图3g显示了与uAgNAs或万古霉素相比，rAgNAs的总生物负荷显着降低（约72.9％），表明其MRSA生物膜的降解率更高。随后，根据琼脂上的菌落形成，进一步探讨了未经处理和经各种抗菌剂处理的MRSA生物膜的细菌生存力（图3h）。根据从共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获得的照片（图3i），rAgNAs处理的生物膜细菌显示出最高的红色/绿色荧光比率，表明rAgNAs可以增加膜的透性，这是杀菌作用的信号之一。

图3 rAgNAs对浮游细菌和细菌生物膜体外抗菌作用的评价

根据rAgNA和uAgNA的组成以及银离子的释放曲线，它们都可以进行酸性微环境加速的银离子浸出。然而，根据上述探索，uAgNAs没有显示出明显的抗生物膜作用。因此，除了银离子浸出速度的差异外，还考虑了生物膜和rAgNA之间的相互作用。通过研究图4a中所示的z轴扫描图像，罗丹明B异硫氰酸酯（RITC）标记的rAgNAs可以穿透并积聚在生物膜中，而RITC标记的uAgNAs则在生物膜的顶部保留了一些，所以rAgNA与生物膜细菌之间存在亲和力（图4b-d）。因此，rAgNAs在抗生物膜上的优越性可归因于（i）生物膜驱动的尺寸转变和电荷反转的酸性微环境，以增强生物膜中的积累和渗透，以及（ii）通过结构分解和酸性双重加速银离子浸出微环境的局部放大杀菌作用（图4e）。

图4 rAgNAs对生物膜放大杀菌效果的增强和深入渗透

考虑到rAgNAs具有潜在的抗生物膜作用，具有增强的渗透和积累以及体外局部放大的杀菌作用，因此开发了一种脓毒症小鼠模型，用于进一步的体内杀菌作用探索（图5a）。静脉内注射rAgNAs后，感染肌肉中的银含量在注射后8小时显着增加，并在注射后24小时保持稳定。此外，从使用RITC标记的rAgNAs处理后的模型小鼠的离体荧光图像可以看出，感染大腿中的高荧光强度证明了rAgNAs在感染部位的有效积累。 rAgNAs以生物膜为目标的成功传递归因于其出色的胶体稳定性，使之能够在体内逐渐循环，然后逐渐在生物膜中积累。如图5c所示，rAgNAs可在治疗10天后显着降低死亡率。根据以下量表评估临床评分：0，无疾病迹象； 1，荷叶边皮草; 2，后肢非常轻度无力； 3，轻度后肢无力； 4，中肢后肢无力； 5，严重的后肢无力/拖拉； 6，后肢功能完全丧失； 7，垂死； 8，死亡。（88）感染后，每组小鼠均表现出非常轻微或轻微的后肢无力。未经治疗（空白组）的小鼠会迅速出现症状恶化，并出现严重的后肢无力，在第1天有几只小鼠的后肢功能完全丧失。用PEG-PSB-PALA，万古霉素或uAgNAs治疗在抑制进展方面不是很有效，而rAgNAs能够抑制恶化的症状（图5d），这由实时超声图像进一步证实（图5e）。rAgNA可以显着减少感染部位的细菌数量。 rAgNAs的优越性还通过酶联免疫吸附测定（ELISA）评估血清TNF-α水平得到了证实，而在rAgNAs治疗组中患有严重脓性肌炎的小鼠的全身性炎症水平明显较低（图5h），表明对进一步感染的抑制作用。此外，血清生化分析和主要器官的组织病理学检查表明rAgNAs具有高度的生物相容性。

图5 rAgNAs治疗多药耐药生物膜诱导的重症肌炎

点评：

1、生物膜响应型纳米抗生素不仅可以增强生物膜的积累和渗透，而且还具有局部激活的杀菌作用，在治疗耐药性细菌生物膜相关的感染性疾病方面显示出巨大的治疗潜力；

2、利用疾病微环境刺激触发原位拆卸/组装纳米粒子，从而实现靶向递送或积聚，值得借鉴。

参考文献：

Wu J, Li F, Hu X, et al. Responsiveassembly of silver nanoclusters with a biofilm locally amplified bactericidal effect to enhance treatments against multi-drug-resistant bacterialinfections[J]. ACS central science, 2019, 5(8): 1366-1376.